３．１　Ｃａ−Ａｌｇ−ＤＣＣのゲル強度

　Ｃａ−Ａｌｇ−ＤＣＣ高分子複合体ゲルのＡｌｇに対するＤＣＣのカルボキシル基の比が０〜３でのゲル強度を図２に示す。
　カルボキシル基の比が０から２に増加するに従って、ゲル強度は増大し、それ以上では減少した。カルボキシル基の比が２の複合体ゲルのときに、ゲル強度は最大値を示し、ＤＣＣを添加していないＣａ−Ａｌｇの場合(カルボキシル基の比が０）に比べて、ゲル強度は約１．３倍に増大した。
　Ｃａ−Ａｌｇ−ＤＣＣは、直線状の高分子であるＤＣＣとＡｌｇとが複合的にＣａ２＋を架橋イオンとしてゲル形成をするため、網目構造の緻密性が増加し、カルボキシル基の比が２まではゲル強度が増大したものと考えられる。ＤＣＣのみのカルシウム塩はゲル化しないため、カルボキシル基の比が２以上に増加した場合には、ゲル強度が減少したものと推定される。

３．２　Ｃａ−Ａｌｇ−ＤＣＣによる酵母の固定化

Ｃａ-Ａｌｇ-ＤＣＣに包括固定した酵母の増殖に及ぼすゲル内カルボキシル基濃度の影響について検討した。その結果を図３に示す。ＤＣＣ濃度を変えて調製した固定化酵母のゲル内パン酵母数は、いずれも１ｍｌゲル当たり２．１×１０７個のものを用いた。合成栄養培地を用いて、３０℃で２４時間培養を行った結果、１ｍｌゲル当たり５．６〜６．２×１０８個と増殖した。
　ゲル内酵母の増殖は、Ｃａ−Ａｌｇ−ＤＣＣの方がＣａ−Ａｌｇに比較して、わずかに大きい傾向が見られたが、複合体ゲルのカルボキシル基濃度による増殖の差はほとんど認められず、同程度であった。

３．３　固定化酵母の増殖曲線
Ａｌｇに対するＤＣＣのカルボキシル基の比が２のＣａ-Ａｌｇ-ＤＣＣに包括固定した酵母の増殖曲線について検討した。その結果を図４に示す。比較のために、Ｃａ−Ａｌｇに包括固定した場合の結果も示した。いずれもゲル内パン酵母数が１ｍｌゲル当たり２．１×１０７個のものを用いた。合成栄養培地を用いて、３０℃、１２０時間培養を行った。ゲル内酵母の増殖は、Ｃａ−Ａｌｇ−ＤＣＣの方がＣａ−Ａｌｇに比較して、わずかに大きい傾向が見られたが、７０時間を越えた時点で新しい培地と交換し、さらに増殖を続けた結果、いずれも１ｍｌゲル当たり１．１×１０９個まで増殖して一定となり、ゲル内酵母数は同程度となった。
　液体培養の菌体数と比較して、１０倍高い酵母密度が得られたことは、ゲル内では、ゲルの緩衝作用によって酵母が外界の環境の変化から保護され、増殖に最も適した環境を選ぶことができる３）ことによるものと考えられる。

図４　固定化酵母の増殖曲線

３．４　固定化酵母のｐＨ依存性
　Ａｌｇに対するＤＣＣのカルボキシル基の比が２のＣａ-Ａｌｇ-ＤＣＣに包括固定した酵母のｐＨ依存性について検討した。その結果を図５に示す。
　比較のために、Ｃａ−Ａｌｇに包括固定した場合と非固定化酵母の場合の結果も示した。固定化酵母 ２０ｍｌ、非固定化酵母２ｇ（湿重量）を用いて、ｐＨ２．３〜４．５の範囲で調製した１０％グルコース含有の反応液５０ｍｌを基質として、３０℃、２時間の糖資化反応を行い、各ｐＨにおける糖資化率を測定した。ｐＨ４．５における糖資化率を１００とした場合の相対活性で示した。
　ｐＨが低くなるにつれて、非固定化酵母では活性が低下し、ｐＨ２．３では６０％程度まで、Ｃａ−Ａｌｇにより固定化した場合でも８０％程度まで相対活性は減少した。しかし、Ｃａ−Ａｌｇ−ＤＣＣを用いて固定化した場合では、ｐＨ３．０〜４．５の間でも活性はほとんど変化せず、ｐＨ２．３においても９０％以上の相対活性を示し、ｐＨ−活性曲線の幅は広くなった。
　酵母は固定化することによって、液体培養の菌体と比べ、ゲルの緩衝作用によって環境の変化から保護されているものと考えられている^３）ことから、カルボキシル基濃度を高めたポリアニオニックな高分子のＣａ−Ａｌｇ−ＤＣＣでは、ｐＨの変動によるゲル内酵母の活性の変化は小さいと考えられ、ｐＨ−活性曲線の幅が広くなったものと推定される。

図５　固定化酵母のｐＨ依存性

３．５　固定化酵母による連続エタノール発酵
Ａｌｇに対するＤＣＣのカルボキシル基の比が２のＣａ-Ａｌｇ-ＤＣＣに包括固定した酵母を用いて、酸性領域（ｐＨ２．５）での連続エタノール発酵について検討を行った。その結果を図６に示す。
１８０時間連続反応を行った結果、生成エタノール濃度、残存グルコース濃度、固定化担体から漏出した流出液中の酵母数はほぼ一定の値を示し、固定化酵母の活性が低ｐＨ領域で一定に保持された安定な発酵状態を示した。
　このことから、Ｃａ−Ａｌｇ−ＤＣＣによる固定化酵母は、ｐＨの低い原料を用いた連続アルコール発酵への応用が可能であると推定される。バイオリアクターによる連続発酵において問題となるのは、雑菌による汚染であり、原料糖液のｐＨを低くすることやアルコール濃度、酵母密度を高めることが必要と考えられている^１０）ことから、低ｐＨ領域での本固定化酵母による連続発酵への応用は、有効な利用法の一つと推定される。

図６　固定化酵母による連続エタノール発酵

　Ｃａ−Ａｌｇ−ＤＣＣ複合体ゲルは、Ｃａ−Ａｌｇゲルよりもゲル強度の向上が見られ、Ａｌｇに対するＤＣＣのカルボキシル基の比が２で最大値を示し、約１．３倍に増大した。Ｃａ−Ａｌｇ−ＤＣＣによる包括固定化酵母は、初発ｐＨ２〜３の酸性領域でも９０％以上の相対活性を示し、ｐＨによる活性の変動がわずかであり、活性領域が酸性側に広がった。さらに、連続エタノール発酵では、ｐＨ２．５の酸性領域で、１８０時間、安定に活性を保持した。

　
参考文献

1. 千畑一郎編：固定化酵素、講談社サイエンティフ ィク(1986).
2. 福井三郎、千畑一郎、鈴木周一編：酵素工学、東 京化学同人(1981).
3. 千畑一郎編：固定化生体触媒、講談社サイエンティフィク(1986).
4. J. Klein, J. Stock and K. D. Vorlop : Eur. J. Microbiol. Biotechnol., 18,86(1983).
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6. B.T.Hofreiter, I. A. Wolff and C. L. Mehltretter : J. Amer. Chem. Soc., 79, 6457(1957).
7. 飯塚広、後藤昭二：酵母の分類同定法、第２版、東京大学出版会(1973)．
8. Ｄ．Ｄ．ペリン、Ｂ．デンプシ−著、辻　啓一訳：緩衝液の選択と応用、講談社サイエンティフィク,p.152(1986).
9. 今井誠一, 松本伊佐尾：味噌技術読本, p.184(1990).
10. 広常正人：醸協、85、13(1990)．